IF,21.1 Protein&Cell│抑制USP8通过SQSTM1/p62介导的铁蛋白自噬增加细胞对铁死亡敏感
★ 前言 ★
2023年3月28日，中山大学医学院感染与免疫研究中心热带疾病控制教育部重点实验室、中山大学医学院感染与免疫研究中心热带疾病控制教育部重点实验室及复旦大学上海医学院华山医院神经外科联合在Protein&Cell发表《Suppression of USP8 sensitizes cells to ferroptosis via SQSTM1/p62-mediated ferritinophagy》的研究论文。研究发现，USP8抑制通过促进癌细胞中铁蛋白的降解来促进铁死亡。在机制上，自噬受体SQSTM1/p62作为一个平台，促进NCOA4和LC3之间的相互作用，从而促进铁蛋白的降解以增强铁死亡敏感性，这个过程由USP8调控。
背景介绍
铁死亡是一种新发现的受调控的细胞死亡形式，其特征是细胞内铁积累增加和随后的脂质过氧化。研究发现，铁死亡在多种生理和病理过程中起着重要作用，包括退行性疾病、癌症发生和癌症免疫治疗。作为一种细胞内铁存储蛋白，铁蛋白通过名为“铁蛋白自噬”的选择性自噬介导的降解过程来调节铁稳态。针对与铁稳态有关的基因已被证实可以调节细胞对铁死亡的敏感性。考虑到癌细胞比非癌细胞对铁的需求增加，以实现生长，癌细胞更容易受到铁催化的铁死亡的影响，因此，诱导铁死亡可以作为癌症治疗的一种有前景的方法。已有报道称，包括OTUB1和BAP1在内的几种去泛素化酶(DUBs)介导了人类癌症中的铁死亡。泛素特异性肽酶8(USP8)最初被鉴定为一种生长调控的DUB，它在生长刺激下累积。尽管USP8的消耗抑制了各种癌细胞的增殖并在一些细胞系中诱导了细胞死亡，但USP8与铁死亡之间是否存在直接联系尚未知晓。研究人员之前的研究发现，USP8通过去泛素化自噬受体SQSTM1/p62(蛋白质酶体1)，从而负面控制自噬。考虑到自噬与铁死亡之间的相关性，假设USP8可能在铁死亡中发挥调节作用。
图文解析
要点1：
A.研究人员构建了USP8基因敲除(KD)的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)，并通过免疫印迹证实。
B-C.CCK8细胞活力检测和PI染色显示，USP8的敲低使细胞对铁死亡敏感。
D.使用荧光探针C11-BODIPY的流式细胞术，Erastin诱导的脂质过氧化（这是铁死亡的典型标志）在shUSP8细胞中显著积累。
E-F.USP8 KD细胞中Erastin诱导的细胞死亡的增加可以通过去铁胺（DFO，一种铁螯合剂）和铁死亡抑制剂-1（Fer-1）逆转，但不能通过凋亡（Z-VADFMK）或坏死（Nec-1s）抑制剂逆转，这表明USP8敲低增加的Erastin诱导的细胞死亡是一个依赖铁死亡的过程。
G-I.此外，USP8的下调显著促进了Erastin诱导的铁死亡事件，包括丙二醛（MDA，脂质过氧化的终产物）的产生，增强的细胞内亚铁离子水平，总活性氧（ROS）和脂质ROS水平，这些可以通过DFO或Fer-1治疗消除。这些结果表明，USP8可能是铁死亡的特异性负调节器，而不是凋亡或坏死的调节器。
J.为了证实USP8抑制是否增强了Erastin在体内的抗癌活性，我们用慢病毒载体稳定地敲除了NCI-H1299细胞中的USP8。在克隆形成实验中，USP8的敲除显著增强了Erastin诱导的铁链细胞死亡。
K.与对照shRNA组相比，USP8基因敲除有效地减少了异种移植小鼠模型中形成的肿瘤大小。
L.通过免疫组织化学（IHC）分析前列腺素内酰胺合酶-2（PTGS2）的表达，PTGS2是评估体内氧化应激和铁死亡的标记，这表明了敲低USP8和Erastin治疗在诱导体内肿瘤铁死亡方面的联合效应。
M.考虑到USP8是一种去泛素化酶，我们测试了铁蛋白自噬的底物FTL是否在USP8调控的铁死亡中被降解。USP8的敲低并未影响FTL mRNA的表达，然而，它显著促进了依拉司丁诱导的HepG2细胞中铁蛋白的降解，这种效应可以通过RNAi抵抗USP8表达恢复。
N-O.在环己酮（CHX，一种蛋白质翻译的抑制剂）存在的情况下，抑制USP8促进了人肝癌细胞系HepG2中内源性FTL蛋白的降解，而USP8的过表达延迟了HEK 293T细胞中外源性FTL蛋白的代谢。
P.BAF(自噬抑制剂)可部分逆转shUSP8细胞中铁蛋白的减少，但BTZ(蛋白酶体抑制剂)则不能，表明USP8基因敲除是通过自噬-溶酶体降解途径破坏铁蛋白的稳定。
Q.推测USP8对铁蛋白的调控是一个自噬相关的过程。然后，用Erastin单独或在BAF存在的情况下处理对照和shUSP8细胞，并检测自噬过程的典型标志Lc3的状态。Erastin处理显著促进shUSP8细胞从LC3I向LC3II的转化，在BAF存在下这一现象更加显著。
R.为了进一步证实吞噬铁蛋白在USP8介导的铁性下垂中的作用，研究人员利用了两种典型的自噬药物：BaF和氯喹(CQ)来阻断自噬。正如预期的那样，BAF和CQ处理都显著减少了Erastin诱导的细胞死亡和shUSP8 MEF中脂质ROS的形成。综上所述，这些数据表明，USP8的下调在铁死亡期间引发铁蛋白自噬并促进铁蛋白的降解。
要点2：
A-B.为了探讨SQSTM1在USP8诱导的铁蛋白吞噬中的作用，研究人员建立了USP8/SQSTM1双基因敲除的HepG2细胞系。结果表明，同时敲除SQSTM1可逆转Erastin诱导的shUSP8细胞死亡。
C-D.此外，我们构建了SQSTM1敲除的HepG2细胞作为对照，shSQSTM1细胞对弹性蛋白诱导的铁死亡具有抵抗力，ATG7或SQSTM1的敲除极大地降低了shUSP8 MEF细胞对擦除蛋白诱导的铁死亡的敏感性，降低了脂质ROS水平，而在shUSP8/shSQSTM1 MEF细胞中重组SQSTM1部分恢复了细胞铁下垂的敏感性，表明USP8介导的铁下垂是一个自噬依赖的过程，涉及SQSTM1的参与。
E.作为铁蛋白自噬的两个重要标记蛋白，核受体共激活因子4（NCOA4）和FTL总是在铁死亡下被降解，这可能由SQSTM1调控。符合实验预期，SQSTM1的耗尽几乎消除了Erastin介导的内源性NCOA4和FTL的下调。
F.野生型SQSTM1的过表达显著促进了NCOA4的降解，但对LIR（与LC3相互作用区域）缺失突变体SQSTM1ΔLIR（在介导选择性自噬方面有缺陷）无影响。
G.在Erastin处理下SQSTM1泛素化增加，这一作用被USP8显著降低，这表明USP8调节的SQSTM1泛素化参与了USP8介导的铁下垂。
H.在Erastin处理下SQSTM1泛素化增加，这一作用被USP8显著降低，这表明USP8调节的SQSTM1泛素化参与了USP8介导的铁下垂。
I.与野生型SQSTM1相比，引入SQSTM1K420R减弱了NCOA4和FTL的降解，这暗示SQSTM1的泛素化对促进这两种蛋白质的降解至关重要。
J.USP8调控的铁死亡是依赖SQSTM1的，而SQSTM1作为自噬受体的功能在这个过程中起着关键作用。为了验证这个假设，我们在HepG2细胞中执行了内源性Co-IP试验，并验证了SQSTM1和NCOA4之间的相互作用。
K.在体外GST下拉实验中，仅在GST-SQSTM1亲和柱中检测到His-NCOA4，表明这两种蛋白质之间存在直接相互作用。
L.尽管NCOA4被认为是铁蛋白自噬受体，但没有直接证据显示NCOA4和LC3之间的相互作用。由于NCOA4没有典型的LC3相互作用区域模式，我们猜测SQSTM1可能在铁蛋白自噬过程中参与NCOA4与LC3的结合。为了测试这个假设，我们评估了NCOA4是否能通过孵育有或没有SQSTM1来与LC3拉下。实验结果显示，只有在添加SQSTM1时，NCOA4才特异性地与LC3相互作用，证明SQSTM1对NCOA4-LC3的识别是必需的。
M.SQSTM1介导的NCOA4-LC3相互作用在体内得到了证实，当SQSTM1K420R突变体共转染时，这种相互作用显著减少，揭示K420的泛素化对NCOA4和LC3在体内的相互作用至关重要。
N.NCOA4和SQSTM1之间的相互作用在Erastin处理下显著增强，这可以通过野生型USP8进行负调控，但去泛素酶活性缺陷突变体C786A则无此效果，这表明USP8的去泛素酶活性对铁死亡的调控至关重要。
O.从机制上讲，自噬受体SQSTM1/p62作为一个平台促进NCOA4和LC3之间的相互作用，从而促进铁蛋白降解以增强铁下垂的敏感性，这一过程由USP8调控。通过上调噬铁蛋白和细胞内铁水平抑制USP8-SQSTM1-NCOA4-铁蛋白轴，使癌细胞对铁死亡敏感。
本文小结：
综上所述，本研究报告了USP8抑制通过促进癌细胞中铁蛋白的降解来促进铁死亡。从机制上讲，自噬受体SQSTM1/p62作为一个平台促进NCOA4和LC3之间的相互作用，从而促进铁蛋白降解以增强铁下垂的敏感性，这一过程由USP8调控。通过上调噬铁蛋白和细胞内铁水平抑制USP8-SQSTM1-NCOA4-铁蛋白轴，使癌细胞对铁死亡敏感。结果表明，USP8在调节癌细胞的铁蛋白自噬和铁死亡反应中发挥重要作用，并揭示USP8可能是铁死亡介导的癌症治疗的潜在靶标。
参考文献：
Liu L, Zheng B, Luo M, Du J, Yang F, Huang C, Ma Z, Li C, Guo D, Peng H. Suppression of USP8 sensitizes cells to ferroptosis via SQSTM1/p62mediated ferritinophagy. Protein Cell. 2023 Apr 13;14(3):230-234.
doi: 10.1093/procel/pwac004.
https://doi.org/10.1093/procel/pwac004