IF 64.8 Nature|康奈尔医学院揭示脊椎骨干细胞驱动转移机制

前言

2023年9月13日康奈尔医学院病理学与实验室医学副教授Matthew Greenblatt团队在《Nature》杂志上在线发表了题为“A vertebral skeletal stem cell lineage driving metastasis”的研究性论文。开辟了一条关于脊椎疾病的新的研究路线，这可能有助于解释为什么实体瘤经常扩散到脊椎。.

背景

研究人员发现，形成脊柱的椎骨（vertebral bone）来源于一种独特的干细胞，这种称为脊椎骨干细胞（vertebral skeletal stem cell）的干细胞不同于其他造骨干细胞，会分泌一种有利于肿瘤转移的蛋白。他们利用脊椎骨干细胞制成的“类器官”，发现已知的肿瘤向脊椎扩散的趋势---比向腿骨等长骨扩散的趋势更多---在很大程度上是由于这些干细胞分泌的这种名为MFGE8的蛋白。

图1

要点1：

a-b.在鉴定vSSCs特异性基因之前，该转录组分析还用于完善SSC免疫表型定义，鉴定出embigin(EMB)作为非干细胞成骨细胞和软骨细胞谱系细胞污染当前SSC定义的标记。

c.在vSSCs中选择性表达的基因中，寻找可用于构建选择性靶向vSSCs的Cre株系的基因，重点关注转录因子。

d-g.因此，构建了Zic1-cre和Pax1-creER^T2小鼠，当与mT/mG报告等位基因杂交时，这两种小鼠都表现出对椎骨的选择性标记。在骨骼中，Zic1-cre对椎骨和长骨提供了绝对的特异性，在长骨中没有检测到信号。与vSSCs的Zic1阳性一致，Zic1-cre标记了多种骨骼谱系，包括终板软骨、成骨细胞、骨髓脂肪细胞、骨髓LEPR⁺细胞、nestin+细胞和椎间盘周围的纤维环。

f.Pax1-creER^T2小鼠的脉冲追踪标记显示，椎终板软骨的初始标记稀疏，随后在接下来的一个月里，标记的克隆通过增殖的软骨柱扩散，最终导致软骨下成骨细胞的标记。

h.Zic1-cre标记的PAX1群体的免疫荧光染色表明，大多数终板zic1谱系细胞在静息区也是PAX1阳性。

图2

要点2：

a.首先，使用Pax1-creERT2;Rosa26confetti小鼠证实了pax1系SSCs对椎体细胞贡献的克隆性，观察到其克隆贡献与使用类似系统报道的长骨SSCs相似，这在增殖的软骨细胞中尤为明显。

b-c.与此一致，使用'tet-off'(R26-M2rtTA;TetOP-H2B-GFP)和'tet-on'(R26-tTA;TetOP-H2B-GFP)脉冲追踪术系统的标记保留研究显示，在软骨终板内的Pax1+人群中，经过6个月的追赶期后，椎骨内的标记保留优先。流式细胞术检测显示这些标记滞留细胞为vSSCs。

d.由于可诱导的Pax1-creERT2系统标记效率较低，Zic1-cre被用于需要分离vSSCs的实验。首先，通过FACS分离的Zic1-lineage vSSCs在移植后形成骨类器官，具有SSCs的功能特征。

e-h.因此，尽管被放置在相同的环境中，vscs和lbscs保留了各自的转录特征和谱系身份。与lbSSCs类似，vscs衍生的类器官包括骨基质形成的成骨细胞，包括宿主来源的造血细胞和移植物来源的骨髓脂肪细胞在内的骨髓内部空间，以及软骨，证明了zic1谱系vscs在体内的多能性。

i-j.此外，Zic1谱系的vSSCs，而不是Zic1谱系的EMB+CD200+细胞，在移植后能够自我更新和重建其整个谱系。

图3

要点3：

a-c.Zic1谱系的血管间充质干细胞对成骨细胞池的贡献表明了它们对椎体骨形成的生理重要性。osterix(由Osx编码)是成骨细胞分化所绝对需要的转录因子，而Zic1-cre的条件缺失选择性地阻断了Zic1谱系的vscs对骨形成的贡献。由此产生的Zic1-cre Osx^fl/fl小鼠表现出严重的椎体缺陷，包括100%外显率的截瘫和伴随的肢体卸载效应，从2周龄开始，由于脊柱不稳定。这对应于严重的脊柱后凸和大部分背神经弓缺失。

d-e.此外，椎体受到严重撞击，骨量减少约50%。

f-g.Zic1-cre Stat3^fl/fl小鼠显示椎体骨量减少，但长骨骨量没有减少，截瘫率仅为10%。

h-i.相反，敲除Schnurri-3((由Shn3(又称Hivep3)编码))-成骨细胞功能和骨形成的细胞内源性抑制剂-with Zic1-cre导致椎体内骨量增加，但长骨参数无明显变化。

图4

要点4：

a-c.为了评估vSSCs在椎体转移趋向性中的作用，首先利用多种转移模型，包括尾动脉注射，心腔内注射和多种同系乳腺癌细胞系自发转移模型，包括EO771，4T1.2和Py8119细胞，证实了在小鼠中优先的椎体和长骨趋向性是保守的。

d.这种椎体趋向性在绝经后骨质疏松的卵巢切除模型中也被保留下来。

e.待这些细胞成分明确的骨类器官成熟矿化4周后，通过尾动脉注射Py8119或4T1.2肿瘤细胞对宿主小鼠进行攻毒。

f.组织学分析表明，浸润到这些骨类器官中的肿瘤细胞与移植物来源的骨细胞在物理上相邻。

g.即使使用该类器官系统使周围的解剖环境正常化后，Zic1-lineage vSSCs来源的骨类器官显示出比lbSSCs更高的转移募集率。

h.这些小鼠在尾动脉攻击Py8119细胞后显示出降低的椎体转移率，表明vSSC系细胞有助于在天然的椎体微环境中转移。

i-j.MFGE8足以在体外诱导肿瘤细胞迁移，在Transwell实验中，Py8119细胞对重组MFGE8表现出剂量依赖性的迁移反应。

K.在Transwell实验中，椎体骨髓基质细胞或vSSCs来源的成骨细胞比长骨诱导Py8119细胞更大程度的迁移，并且这种效应依赖于Mfge8，因为来自Mfge8^-/-小鼠的相同椎体和长骨群体不再显示出诱导迁移的差异能力。

m.MFGE8也促进了体内的椎体转移，因为Mfge8^-/-小鼠在尾动脉攻击Py8119细胞后显示出明显降低的椎体转移率。

n.在这种情况下，mfge8缺失的vSSCs衍生的类器官显示出明显降低的转移性募集率。

o-p.MFGE8还调节转移性肿瘤细胞的播种后生长，因为直接注射到MFGE8^−/−宿主的L6椎骨后，Py8119细胞的生长减少。因此，MFGE8调控早期转移的早期播种和随后的生长。

图5

要点5：

a.接下来，研究人员鉴定了小鼠vSSCs的人类对应体。在人类终板中鉴定了一个共表达ZIC1和PAX1的群体。

b.利用流式细胞术，还鉴定了一个表达与小鼠vSSCs(Lin^-THY1^-CD105^-CD200⁺EMB^-),以下简称人vSSCs)类似的一组标记的群体。

c-g.相对于人lbSSCs，人vSSCs表现出PAX1和ZIC1的选择性表达，人vSSCs表现出与小鼠vSSCs相似的干性特征，在异种移植到高度免疫缺陷的NSG小鼠体内后，具有形成骨类器官的能力，包括产生软骨细胞和骨基质形成成骨细胞。

h-i.移植后，人间充质干细胞能够维持自身，并伴随向其他人群分化与小鼠Zic1 vSSC谱系中观察到的其他细胞类型相对应。

j-k.因此，人类和小鼠共享类似的vSSC种群。为了研究人类vSSCs是否像小鼠研究中所证明的那样，在椎体转移中表现出保守的参与机制，首先证实了人类MDA231-BoM-1833乳腺癌细胞在体外对MFGE8有反应。接下来，用慢病毒RNA(shRNA)，靶向MFGE8或GFP对照，转导FACS分离的人vSSCs。然后将这些转导的细胞植入，并在MDA231-BoM-1833细胞攻击尾动脉之前形成骨类器官。i.缺乏MFGE8的人类vSSCs衍生的类器官显示出转移率降低，证实了vSSCs衍生的MFGE8是人类异种移植系统中转移的相关驱动因素。

小结

综上所述，本研究为长期以来关于乳腺癌椎体转移性的临床观察提供了解释，至少部分地将这种效应映射到该研究确定的特定vSSCs谱系，并确定MFGE8是vSSC谱系衍生的这种效应的介质。

参考文献：Jun S,Lingling H,Seoyeon B.et al.A vertebral skeletal stem cell lineage driving metastasis.Nature 2023 Sep;621(7979):602-609.

doi: 10.1038/s41586-023-06519-1.