前言

2023年10月4日，空军军医大学张丰及军事医学科学院孙强共同通讯（空军军医大学为第一单位）在Nature在线发表题为“An extra-erythrocyte role of haemoglobin body in chondrocyte hypoxia adaption”的研究论文，该研究发现软骨细胞产生大量的血红蛋白，在其细胞质中形成伊红（eosin）阳性小体。血红蛋白体(Hedy)是一种以相分离为特征的无膜凝聚体。软骨细胞中血红蛋白的产生受缺氧控制，依赖于KLF1而不是HIF1/2α途径。

背景介绍

O₂是许多反应中不可缺少的代谢底物，也是细胞生存所必需的。大多数哺乳动物细胞的氧气供应依赖于红细胞(RBC)中的血红蛋白通过血管系统连续输送氧气。相比之下，软骨组织是独特的无血管组织，软骨内软骨细胞所需的氧气从周围组织扩散而来。在胚胎发育过程中，胎儿生长板在没有血管的情况下扩张，导致软骨模具中心缺氧增强。然而，软骨细胞适应缺氧环境的机制在很大程度上仍不清楚。

图文解析

图1

要点1：

a-b.在检查新生小鼠软骨生长板时，观察到增生性软骨细胞中有一种伊红阳性结构。扫描电镜证实，这些结构的大小和形状与骨髓中的红细胞相似。在其他软骨组织(如小鼠的肋骨和跟骨)的肥大软骨细胞中也检测到伊红阳性结构。

c-d.除了肥大的软骨细胞外，这些结构也存在于小鼠软骨静息区和增殖区的软骨细胞中，尽管它们是不规则的。此外，在人软骨中也检测到类似的结构。因此，无论来源和种类如何，伊红阳性结构可能是软骨细胞的共同特征。

e-f.通过小鼠肱骨软骨的免疫组织化学和免疫电镜染色原位检测软骨细胞中血红蛋白的表达，血红蛋白-α亚基( HBA )和血红蛋白-β亚基(HBB)。的细胞质染色模式清晰。从小鼠软骨中分离的软骨细胞也得到了类似的结果。总之，这些结果表明，软骨组织的软骨细胞产生大量的血红蛋白，主要是HBB，形成一种细胞质伊红阳性结构，研究人员称之为Hedy。

图2

要点2：

a-b.为了进一步探索Hedy的性质，进行了透射电镜分析。Hedy结构显然是一种分离于软骨细胞细胞质中的无膜凝结物。一致地，软骨细胞的低渗破裂导致作为孤立个体的伊红阳性结构释放。

c-d.单独表达HBB，或与HBA一起表达，在不同细胞系中产生细胞质凝聚物(也称为灶)。

e.荧光染色显示，病灶不富含脂质和核酸。以HBB为例，探讨细胞质病灶的特点。

f-g.延时显微镜显示，这些焦点很容易相互融合，并在细胞中迅速从光漂白中恢复，表明焦点的动态性质类似于通过相分离的蛋白质凝聚物。

h.此外，通过相关的光电子显微镜和免疫电子透射显微镜发现，这些细胞质凝聚物没有被双叶膜包围。序列分析鉴定出两个短的内在无序区(IDRs)，它们通常富含相分离蛋白中，分别位于HBB的N端和C端。

i-k.截断C端IDR或两个IDR，但不截断N端IDR，显著抑制细胞质灶的形成。C端IDR中的A139P突变，与β-地中海贫血相关的因果突变，也显著损害了培养细胞中的病灶形成，但对蛋白质表达水平基本上没有影响。这些突变破坏了体外HBB的凝结，但不能完全阻止。因此，HBB的C端IDR是有效形成细胞质凝聚物所必需的。总之，这些数据与血红蛋白相分离促进Hedy形成的观点相吻合。

图3

要点3：

a.为了研究软骨中是否发生了珠蛋白转换，对不同发育阶段的软骨进行了反转录定量PCR (RT-qPCR)。结果显示，胚胎的ζ-珠蛋白、εy-珠蛋白和βh1-珠蛋白在胚胎早期(E14.5)胚胎生长板的软骨细胞中高表达，但在胚胎晚期和成人生长板的软骨细胞中急剧下降至检测不到的水平(E18.5和P7)。相比之下，胎儿/成人α-珠蛋白和β-珠蛋白在E14.5胎生长板中表达最低，而在E18.5和P7小鼠生长板中表达较高。因此，珠蛋白转换也发生在发育中的软骨中，其方式与红细胞发育过程中类似。

b-c.缺氧是一种确定的血红蛋白表达诱导剂。为了测试这种机制是否也在软骨细胞中起作用，检测了缺氧环境下培养软骨组织中Hba和Hbb的转录。

d-e.正如预期的那样，缺氧时Hba和Hbb的mRNA水平上调，这在原代软骨细胞中得到了证实。同时，诱导Hif1a、Epo和Epor转录，但不诱导Hif2a转录。为了测试血红蛋白的表达是否受到缺氧激活的HIF信号通路的调节，检测了hif1a缺失和hif2a缺失软骨细胞中Hba和Hbb的mRNA水平。与先前的报道一致，软骨细胞中Hif1a的纯合缺失，而不是Hif2a的纯合缺失，导致软骨生长板中心的大量细胞死亡。单独或联合敲除Hif1a和Hif2a，在常氧和缺氧条件下均可降低原代培养软骨细胞和胎儿生长板中Epo的表达。然而，在敲除Hif1a和/或Hif2a后，Hba和Hbb的表达出乎意料地被诱导，这进一步被GN44028和PT2385或PT2399对HIF1α的化学抑制以及IOX2、roxadustat和DMOG对HIF1α和HIF2α的化学激活结果所证实。这些结果表明缺氧不太可能通过HIF1/2α促进软骨细胞中血红蛋白的表达。

f.接下来，检测了缺氧胁迫下红细胞生成的关键转录因子KLF1、RUNX1和GATA1的表达。缺氧显著促进了原代软骨细胞中Klf1的转录，但对Runx1或Gata1的转录没有影响。

g-h.先前有报道称KLF1对于珠蛋白转换至关重要，其缺失导致小鼠β-地中海贫血。因此，研究了它对血红蛋白表达的调节。

i-k.条件敲除或短干扰RNA介导的Klf1敲除显著降低了原代软骨细胞和ATDC5软骨细胞中Hba和Hbb的表达。与此结果一致，染色质免疫沉淀(ChIP) -qPCR结果显示，Klf直接结合了软骨细胞中α-珠蛋白和β-珠蛋白基因位点的位点控制区增强子和启动子区域。因此，这些结果支持KLF1可以介导缺氧诱导的软骨细胞中Hba和Hbb的表达。

图4

要点4：

a-c.由于血红蛋白是一种氧载体，假设软骨中的血红蛋白敲除可能导致缺氧，从而导致软骨细胞死亡。组织组织学和透射电镜分析显示，Hbb-cKO导致软骨生长板软骨细胞Hedy丢失，并伴有EF5信号增加，表明敲除Hbb后软骨缺氧水平增加。与此一致，Hbb-cKO软骨表达了更高水平的HIF1a。

d.为检验血红蛋白在软骨细胞缺氧耐受中的重要作用，采用E18.5肱骨软骨生长板在缺氧环境(1%O₂)中培养3天进行缺氧耐受实验。结果显示，即使部分缺失Hba或Hbb也会使软骨生长板中的软骨细胞致氧死亡，这在培养6天的E14.5软骨中得到进一步证实。

e.与此一致，与红细胞相比，血红蛋白表达完整的WT软骨细胞倾向于在更缺氧的条件下释放氧气，这表明P50(血红蛋白50%饱和时的氧分压)要低得多(27.85 mmHg对58.2 mmHg);相反，Hbb缺失的软骨细胞表现出与氧气结合和供应的边际能力。

f-g.为了证实Hedy可能在缺氧时作为氧气来源发挥作用，通过低渗破裂的方法分离了Hedy，将HBA-mCherry和HBB-GFP共转染239T细胞。将分离的Hedies与PC12(一种缺氧敏感细胞)共培养24小时，有效地逆转了上调的HIF1α表达，其水平与RBC共培养和缺氧对照相当。此外，在共培养实验中，表达血红蛋白的ATDC细胞比邻近的血红蛋白阴性细胞对缺氧的耐受性更强，这是由HIF1α的核定位确定的。因此，这些数据与细胞内血红蛋白(Hedy)作为局部氧储存提供氧气以维持软骨局部缺氧时软骨细胞存活的观点是一致的。

本文小结

综上所述，在这里报道软骨细胞使用类似的策略来适应软骨生长板的缺氧环境。相反，软骨细胞不产生组织特异性的珠蛋白，而是表达一种独特的血红蛋白组成，在其细胞质内形成无膜的血红蛋白。与来自同一小鼠的红细胞(58.2mmHg)相比，含hedy软骨细胞的P50明显左移(27.58mmHg)。左移的P50使软骨细胞能够结合并储存从缺氧环境中扩散的氧气，以供短途供应。这对发育中的生长板中软骨细胞的存活是至关重要的，因为血红蛋白的消耗和随后的Hedy损失会导致软骨细胞大量死亡和骨骼发育迟缓。这是第一个基于小鼠模型证明血红蛋白在软骨细胞中的红细胞外作用的研究。

参考文献：

Zhang, F., Zhang, B., Wang, Y. et al. An extra-erythrocyte role of haemoglobin body in chondrocyte hypoxia adaption. Nature (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06611-6