IF 30.5 Nature Immunology丨IRF4对营养吸收的控制协调了先天性免疫记忆
IF 30.5 Nature Immunology丨IRF4对营养吸收的控制协调了先天性免疫记忆
前言
2023年9月11日凯特林癌症研究中心Joseph C. Sun团队等研究人员在《Nature Immunology》杂志上在线发表了题为“Control of nutrient uptake by IRF4 orchestrates innate immune memory”的研究性论文。该研究表明，IRF4是一个信号整合因子，作为次级代谢检查点来协调NK细胞在病毒感染期间的适应性反应。
背景
自然杀伤细胞(NK)是具有适应性免疫特性的天然细胞毒性淋巴细胞，包括抗原特异性、克隆扩增和记忆。因此，NK细胞与其适应性CD8+ T细胞兄弟姐妹共享许多转录和表观遗传程序。病毒感染期间，小鼠和人体内NK细胞的最佳反应需要抗原、共刺激和促炎细胞因子等各种信号;然而，这些信号的整合仍然不清楚。在这项研究中，研究人员发现转录因子IRF4整合信号来协调小鼠巨细胞病毒感染期间NK细胞的反应。IRF4的缺失不利于病毒特异性NK细胞的扩增和分化。这种缺陷部分归因于缺乏irf4的NK细胞无法摄取生存和记忆生成所需的营养。
图1
要点1：
a-c.观察到IRF4在MCMV感染后早期在Ly49H+NK细胞中高度上调，转录物和蛋白水平分别在感染后第2天和第3天达到峰值。
d.单细胞ATAC测序(scATAC-seq)数据显示适应性NK细胞(NKG2C+CD56dim)在表观遗传学上不同于较不成熟的CD56bright、早期CD56dim和常规CD56dim NK细胞。
e.与其他NK细胞群相比，这种独特的表观遗传特征部分与适应性NKG2C+ NK细胞亚群中IRF4启动子的高可及性有关，与在小鼠Ly49H+ NK细胞对MCMV的反应中观察到的结果一致。
f.另一项研究的RNA-seq分析也表明，IRF4转录本在适应性NKG2C+ NK亚群中最高。
g-h.此外，IRF8和IRF9的诱导主要依赖于IL-12-STAT4和IIFN-STAT1轴，在小鼠和人类中，NK细胞中IRF4的最佳表达除了稳态和促炎细胞因子外，还需要来自激活受体的协同信号。因此，IRF4可能作为一个保守的“枢纽”，在跨物种的抗病毒NK细胞反应中整合多种信号。
图2
要点2：
a.与接受WT Ly49H+ NK细胞的小鼠相比，接受Irf4−/−Ly49H+ NK细胞的小鼠迅速屈服于MCMV，类似于未接受细胞的Rag2−/−Il2rg−/−小鼠，这表明NK细胞固有的Irf4是保护宿主免受MCMV的必要条件。
b.WT Ly49H+ NK细胞在第7天的PI时扩增强劲，而它们的Irf4−/−对应物未能扩增，因此在30天后形成了一个小得多的记忆细胞池。
c.此外，在包括血液、脾脏和肝脏在内的多个不同组织中也观察到Irf4−/−NK细胞的这种扩增缺陷。为了确定Irf4−/−NK细胞的扩增缺陷是否由增殖失败引起，在转移和感染前用细胞微量紫(CellTrace Violet,CTV)标记WT和Irf4−/−Ly49H+ NK细胞。
d-e.与CD8+ T细胞的类似观察结果一致，基于CTV稀释，Irf4−/−Ly49H+ NK细胞与WT Ly49H+ NK细胞的分裂能力相当;然而，与WT NK细胞相比，激活的Irf4−/−NK细胞未能下调促凋亡分子BIM。
f.因此，与WT NK细胞相比，Irf4−/−NK细胞具有更高的BIM表达，并且在BCL2抑制剂处理后对细胞死亡更敏感。因此，这些数据表明IRF4通过调节BIM的表达来控制病毒感染期间NK细胞的存活。
图3
要点3：
为了研究IRF4是否促进活化NK细胞的分化，在第7天对不同组织的WT和IRF4−/−Ly49H+ NK细胞亚群进行了分析。
a.发现，在所有组织中，与WT相比，Irf4−/−NK细胞具有更高比例的未成熟细胞分数(CD27+ CD62L+)，并且成熟细胞(CD27−CD62L−)的严重损失。
b.此外，与WT NK细胞相比，Irf4−/−NK细胞显示成熟标志物Ly6C和CX3CR1的减少，KLRG1的表达略有下降。c.总之，这些数据表明IRF4在感染期间控制NK细胞分化，并有助于适应性NK细胞反应的异质性。为了更好地了解IRF4何时发挥作用，用MCMV感染WT:IRF4−/−mBMC小鼠，并在一个紧密的动力学窗口(即第0,2,4,5和7天)对Ly49H+ NK细胞区室进行表型表征。在mBMC环境下，Irf4−/−Ly49H+ NK细胞从第4天开始逐渐丧失，并持续下降至第7天。
d.在继代转移环境中的观察结果一致，基于CD27和CD62L的WT和Irf4−/−NK细胞的表型分析显示，在第4天至第7天，未成熟双阳性(CD27+ CD62L+)细胞的积累，这与Irf4−/−NK细胞成熟双阴性(CD27−CD62L−)比例的严重减少相吻合。因此，IRF4是可能的调控转录程序，控制NK细胞在病毒感染后早期的存活和分化。
图4
要点4：
a.接下来，在MCMV感染后的第0、2、4和7天对WT和Irf4−/−Ly49H+ NK细胞进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)。无监督Louvain聚类(kn=30)确定了12个主要描述感染动力学的聚类。初始NK细胞(第0天)由簇0和4表示，第2天的NK细胞由簇7、9和11识别，第4天的NK细胞由簇2、5、6和8区分，第7天的NK细胞富集在簇1和3中。
b.对前50个差异表达最多的基因(DEGs)的分析表明，在第7天，WT和Irf4−/−NK细胞之间存在不同的基因表达模式，
c.总体而言，基于分区的图抽象(PAGA)分析也表明，第7天的Irf4−/−NK细胞比第7天的WT NK细胞与幼稚NK细胞的关系更密切。
d.此外，WT和Irf4−/−NK细胞之间差异表达的基因数量在PI第4天增加到62个基因，在PI第7天增加到2178个基因(Padj<0.05))，这与PI第7天的均匀歧形近似和投影(UMAP)嵌入一致，其中WT和Irf4−/−细胞彼此分离最多。
e-f.与WT细胞相比，在Irf4−/−NK细胞中被发现明显失调的基因中，许多与NK细胞和效应CD8+ T细胞的分化有关(例如Tbx21、Eomes、Zeb2、Runx1、Runx3、Id2和Fli1)或与淋巴细胞成熟相关。
g.基因评分分析也证实，第7天的Irf4−/−NK细胞富含与“记忆前体”效应细胞(MPECs)相关的基因，而WT NK细胞群表现出更大的“短寿命”效应细胞(SLEC)特征。此外，还证实，与WT细胞相比，Irf4−/−NK细胞未能在转录水平下调BIM(由Bcl2l11编码)，这可能是由于Irf4直接抑制了BIM。总之,这些数据表明，IRF4驱动转录程序，在病毒感染期间调节NK细胞的存活和分化。
图5
要点5：
a.基因集富集分析(GSEA)途径分析WT和IRF4-/-NK细胞之间的DEG在第7天的PI也表明，WT细胞富集了参与代谢过程的基因(例如氧化磷酸化)和已知受MYC调节的基因。
b-c.MYC本身在感染后早期上调，但WT和Irf4−/−NK细胞在转录物和蛋白水平上的MYC表达没有差异;然而，在感染期间，Irf4−/−NK细胞中已知MYC靶点，即CD98和CD71的表达明显失调，这表明存在独立于MYC或与MYC合作的额外调节层，但不完全依赖于MYC。由Slc3a2编码的CD98是LAT1(Slc7a5)的异源二聚体伴侣，需要调节大l型中性氨基酸的摄入，而CD71，也被称为转铁蛋白受体(Tfrc)，在铁摄取中起重要作用。因此，铁获取失败已被证明会显著影响对各种感染的先天和适应性免疫。
d.为了确定CD98表达的减少是否会影响Irf4−/−NK细胞摄取大量中性氨基酸的能力，分析了它们摄取荧光中性氨基酸类似物犬尿氨酸的能力。与WT NK细胞相比，Irf4−/−NK细胞显示犬尿氨酸摄取减少。添加中性氨基酸竞争对手(亮氨酸)降低了犬尿氨酸的总体摄取，但在这种情况下，与WT NK细胞相比，Irf4−/−NK细胞对犬尿氨酸的摄取仍然减少。
e.同样，为了评估CD71在WT与Irf4−/−Ly49H+ NK细胞中的功能，进行了离体转铁蛋白摄取测定，发现未处理WT和Irf4−/−群体之间的转铁蛋白摄取没有差异;然而，在MCMV感染期间，WT NK细胞很容易吸收转铁蛋白，而Irf4−/−NK细胞的转铁蛋白摄取受损。总的来说，研究结果表明，IRF4控制NK细胞摄取多种营养物质的能力，这些营养物质可能是最佳抗病毒NK细胞反应所必需的。
图6
要点6：
a.还通过使用PBS或铁螯合剂去铁素(deiprone)治疗MCMV感染的WT小鼠，评估了铁在驱动这些过程中的作用。
b-c.观察到去铁蛋白诱导MCMV应答的NK细胞缺铁，CD71表达增加证明了这一点。与LAT1-CD98抑制相比，去铁酚酮处理的小鼠在血液、肝脏和脾脏中抗病毒NK细胞扩增的比例和细胞数量均严重减少。
d.此外，PBS处理小鼠的Ly49H+ NK细胞可以分化为成熟的CD27-CD62L-细胞，而去铁酚酮处理的NK细胞富集为未成熟细胞，类似于Irf4-/-NK细胞。
e-f.此外，与对照组相比，去铁酮处理小鼠的Ly49H+ NK细胞表现出CX3CR1和KLRG1等成熟标记物的失调，并保持高水平的BIM。
g.最后，观察到PBS处理组和去铁酚酮处理组之间的增殖(基于Ki-67染色)没有显著差异。由于在Irf4−/−NK细胞中观察到的表型在去铁酚酮处理的小鼠中得到了很好的再现，假设在Irf4−/−NK细胞中观察到的铁摄取中断导致了抗病毒NK细胞适应性反应的缺陷。
图7
要点7：
a.共鉴定出12344个irf4结合峰，与未受刺激的对照相比，其中大多数峰是在受刺激条件下特异性发现的(n=10,795)。b.值得注意的是，观察到IRF4直接结合到Bcl2l11和Sell位点，表明其分别直接调节细胞存活和分化。此外，还观察到IRF4与编码铁摄取机制成分的Tfrc和Ireb2位点的强直接结合。因此，这些观察结果强调了IRF4参与直接调节NK细胞的存活、分化和营养摄取，以实现适应性NK细胞反应。为了全面了解IRF4如何调节分化NK细胞对MCMV的转录格局，将IRF4结合的基因与WT和IRF4−/−Ly49H+的基因进行了比较第7天NK细胞。c.值得注意的是，发现近40%的DEG是IRF4的直接靶点，并且这些IRF4结合的DEG中的大多数在IRF4−/−NK细胞中上调，这表明IRF4在病毒感染后NK细胞分化过程中主要充当转录抑制因子。d.此外，发现IRF4的占用主要富集在内含子和基因间区域，在启动子和外显子中的占比较低，这表明IRF4优先结合到假定的远端增强子上。e.此外，基序富集分析显示，AP-1和AICE(AP-1-IRF复合元件)以及IRF基序在刺激后在IRF4结合位点高度富集，这表明IRF4与AP-1因子在控制最佳NK细胞反应中的潜在相互作用，类似于在T细胞中观察到的情况。f.从这一分析中，发现与其他时间点相比，IRF4结合的含有AP-1、AICE和IRF基序的区域在PI的第2天和第4天具有高度可达性，其中含有AICE基序的区域在PI的第2天和第4天具有相当的可达性，这表明IRF4与染色质的时间结合可能在PI的第2天至第4天窗口期间被促进并发生。g.最后，为了研究MCMV感染期间NK细胞中IRF4控制的含AICE基序基因的调控网络，重点研究了IRF4结合的含AICE基序基因的表达模式，这些基因在感染期间的任何时间点都表现出差异表达(n=686个基因)。然后，使用WT与Irf4-/-NK细胞之间的DEG在所有时间点作为定制的“途径”进行GSEA分析，并绘制平均值各类别中富集基因的表达。与其作为转录抑制因子的作用一致，在缺乏IRF4的情况下，含有AICE基序的基因在感染后被抑制，而在WT NK细胞中富集的基因在第4天出现上调，并在此后保持表达，这表明IRF4和AP-1因子之间的相互作用可能共同作为转录抑制因子，协调效应NK细胞和记忆NK细胞在病毒感染下的分化。
小结
综上所述，本研究揭示了IRF4在整合输入信号以将NK细胞的固有效应功能与其适应性反应解耦联方面的新作用。IRF4通过时序性调节克隆扩增NK细胞存活和分化所需的铁摄取，直接控制NK细胞的适应性反应。此发现为营养物质和矿物质调节NK细胞的抗病毒反应提供了新的见解。总而言之，该研究强调了NK细胞对感染产生应答的转录、表观遗传和代谢要求，这有助于改善NK细胞为基础的治疗方法。
参考文献：Endi K.S、Hyunu K、Timo R.et al.Control of nutrient uptake by IRF4 orchestrates innate immune memory .Nature Immunology.2023 Oct;24(10):1685-1697.doi: 10.1038/s41590-023-01620-z.
https://www.nature.com/articles/s41590-023-01620-z